Реакция на белок

Реакция на белок

Присутствие белков в биологических объектах или растворах можно определить с помощью цветных реакций, протекание которых обусловлено наличием в белке специфических групп и пептидных связей.

Реактивы: водный раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 15–20-кратном объеме дистиллированной воды, затем раствор фильтруют через марлю, сложенную в 3–4 слоя, и хранят в холодильнике;10 %-й раствор гидроксида натрия; 30 %-й раствор гидроксида натрия; 1 %-ный раствор сульфата меди; 1 %-й раствор ацетата свинца; концентрированная азотная кислота; 0,5 %-й раствор нингидрина.

Оборудование: пробирки; водяная баня или спиртовка.

Задание 1. Биуретовая реакция.

В щелочной среде белки, а также продукты их гидролиза – пептиды дают фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание с солями меди. Реакция обязана наличию пептидных связей в белках:

Интенсивность окраски зависит от длины полипептида.

Ход работы

1. В пробирку налейте 5 капель раствора яичного белка, затем 10 капель 10 %-го раствора щелочи.
2. Добавьте 1–2 капли раствора сульфата меди, смесь перемешайте. Появляется красно-фиолетовое окрашивание.

Задание 2. Ксантопротеиновая реакция.

Реакция характерна для некоторых ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана), а также для пептидов, их содержащих. При действии азотной кислоты образуется нитросоединение желтого цвета. Далее нитропроизводные могут реагировать со щелочью с образованием натриевой соли, имеющей желто-оранжевое окрашивание:

Ход работы

Данную работу необходимо выполнять в вытяжном шкафу, соблюдая особую осторожность!

1. В пробирку налейте 5 капель раствора яичного белка и ОСТОРОЖНО по стенке прибавьте 3–4 капли концентрированной азотной кислоты.
2. Смесь осторожно нагрейте. Выпадает осадок, который окрашивается в желтый цвет.
3. После охлаждения в пробирку ОСТОРОЖНО по стенке прилейте 10 капель 30 %-го раствора NaOH, желтая окраска переходит в оранжевую.

Задание 3. Реакция на серусодержащие аминокислоты (реак ция Фоля).

В остатках серусодержащих аминокислот цистеина и цистина сера при щелочном гидролизе отщепляется, образуя сульфиды. Сульфиды, взаимодействуя с ацетатом свинца, образуют осадок сульфида свинца черного или буро-черного цвета.

Ход работы

1. В пробирке смешайте 5 капель раствора яичного белка, 5 капель 30 %-го раствора щелочи и 2 капли раствора ацетата свинца.
2. Смесь осторожно нагрейте на спиртовке до кипения и кипятите. Через некоторое время появляется буровато-черное или черное окрашивание.

Задание 4. Нингидриновая реакция.

Реакция характерна для аминогрупп в α-положении и обусловлена наличием α-аминокислот в молекуле белка. При нагревании белка с водным раствором нингидрина аминокислоты окисляются и распадаются, образуя двуокись углерода, аммиак и соответствующий альдегид. Восстановленный нингидрин конденсируется с аммиаком и окисленной молекулой нингидрина, образуя соединение фиолетово-синего цвета:

Ход работы

В пробирку вносят 5 капель 1 %–го раствора яичного белка, добавляют по 3 капли 0,5 %-го раствора нингидрина и нагревают до кипения. Через 2–3 минуты появляется розовое, красное, а затем сине-фиолетовое окрашивание.

Оформление результатов

Оформите проведенные исследования в виде таблицы.

Реакция на белок

По химическому составу белки делятся на две группы:

а) простые белки – протеины, которые при гидролизе распадаются только на аминокислоты;

б) сложные белки или протеиды, образующие при гидролизе аминокислоты и вещества небелковой природы (углеводы, нуклеиновые кислоты и др.) — соединения белковых веществ с небелковыми.

1. Амфотерные свойства белков

Как и аминокислоты, белки являются амфотерными соединениями, так как молекула любого белка содержит на одном конце группу -NH₂, а на другом конце – группу -СООН.

Так, при действии щелочей белок реагирует в форме аниона – соединяется с катионом щелочи:

При действии же кислот он выступает в форме катиона:

Если в молекуле белка преобладают карбоксильные группы, то он проявляет свойства кислот, если же преобладают аминогруппы, — свойства оснований.

Очень важным для жизнедеятельности живых организмов является буферное свойство белков, т.е. способность связывать как кислоты, так и основания, и поддерживать постоянное значение рН различных систем живого организма.

Белки обладают и специфическими физико-химическими свойствами.

2. Денатурация белка (необратимое осаждение, свертывание)

Денатурация – это разрушение вторичной и третичной структуры белка (полное или частичное) и изменение его природных свойств с сохранением первичной структуры белка.

Сущность денатурации белка сводится к разрушению связей, обусловливающих вторичную и третичную структуры молекулы (водородных, солевых и других мостиков). А это приводит к дезориентации конфигурации белковой молекулы.

Денатурация бывает обратимой и необратимой.

Обратимая денатурация белка происходит при употреблении алкоголя, солёной пищи.

Необратимая денатурация может быть вызвана при действии таких реагентов, как концентрированные кислоты и щелочи, спирты, в результате воздействия высокой температуры, радиации, при отравлении организма солями тяжелых металлов (Hg 2+ , Pb 2+ , Си 2+ ).

Например, яичный белок альбумин осаждается из раствора (свертывается) при варке яиц (при температуре 60-70 0 С), теряя способность растворяться в воде.

Видеоопыт «Свертывание белков при нагревании»

Видеоопыт «Осаждение белков солями тяжелых металлов»

Видеоопыт «Осаждение белков спиртом»

3. Гидролиз белков

Гидролиз белков – это необратимое разрушение первичной структуры в кислом или щелочном растворе с образованием аминокислот.

Анализируя продукты гидролиза, можно установить количественный состав белков.

Переваривание белков в организме по своей сути представляет ферментативный гидролиз белковых молекул.

В лабораторных условиях и в промышленности проводится кислотный гидролиз.

В ходе гидролиза белков происходит разрушение пептидных связей. Гидролиз белка имеет ступенчатый характер:

5. Цветные (качественные) реакции на белки

Для белков известно несколько качественных реакций.

а) Ксантопротеиновая реакция (на остатки аминокислот, содержащих бензольные кольца)

Белки, содержащие остатки ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина), дают желтое окрашивание при действии концентрированной азотной кислоты.

Причина появления окраски – образование нитропроизводных ароматических аминокислот, например, фенилаланина:

Видеоопыт «Ксантопротеиновая реакция на белки»

б) Биуретовая реакция (на пептидные связи)

Все соединения, содержащие пептидную связь, дают фиолетовое окрашивание при действии на них солей меди (II) в щелочном растворе.

Причина появления окраски – образование комплексных соединений с координационным узлом:

Видеоопыт «Биуретовая реакция белков»

Видеоопыт «Качественные реакции на белки: биуретовая и ксантопротеиновая»

в) Цистеиновая реакция (на остатки аминокислот, содержащих серу)

Причина появления окраски – образование черного осадка сульфида серебра (II) PbS.

Видеоопыт «Качественное определение азота в органических соединениях»

РАБОТА 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты

ПМ 03 «Проведение лабораторных биохимических исследований»

Тема: «Свойства белков. Качественные реакции на белки и аминокислоты»

Учебные вопросы для самоподготовки студентов

1. Классификация белков (простые и сложные белки).

2. Характеристика простых белков (альбумины и глобулины, проламины и глютелины, протамины и гистоны, протеиноиды).

3. Нуклеопротеины. Строение ДНК, локализация, биологическая роль. Строение РНК, типы РНК (м-РНК, т-РНК, р-РНК), биологическая роль.

4. Характеристика липопротеинов. Особенности строения свободных липопротеинов плазмы крови, схема строения липопротеидной частицы. Классификация липопротеинов плазмы крови, место образования, биологическая роль.

5. Характеристика гликопротеинов. Особенности строения протеогликанов; классификация гликозаминогликанов., распространение в организме, биологическая роль.

6. Хромопротеины, классификация. Строение гемоглобина (Hb). Производные гемоглобина (окси-, карбокси-, карб- и метгемоглобин). Типы гемоглобина (эмбриональные Нb, HbA, HbF, HbS и др.). Ферментные гемопротеины, особенности функционирования, биологическая роль каталазы, пероксидазы и цитохромов.

На занятии студенты пишут обучающий тест.

На занятии студенты выполняют лабораторную работу: 1) цветные реакции на белки и аминокислоты; 2) качественные реакции на индикан и фенилпировиноградную кислоту.

Формулы, необходимые для запоминания:

· Азотистые основания: аденин, гуанин, урацил, тимин, цитозин.

· Схема строения мононуклеотида.

· Дисахаридные единицы гиалуроновой кислоты и хондроитин-4-сульфата.

Литература: Пустовалова Л.М. Основы биохимии для медицинских колледжей. Изд. Феникс, 2003, с.44-62; Кухта В.К. и соав. Основы биохимии. – М., Медицина, 1999, с.69-86, 33-34, 209-215, 299-302; Кухта В.К. и соав. Основы биохимии. – М., Медицина, 2007, с. 75-94,37-39, 220-226, 310-311. Конспекты лекций по курсу биохимии и практический занятий по темам; «Химия углеводов» и «Химия липидов».

Cпециальность 0407 «Лабораторная диагностика».

ПМ 03 «Проведение лабораторных биохимических исследований»

ЗАНЯТИЕ № 4: «Свойства белков. Качественные реакции на белки и аминокислоты»

Методические указания для выполнения самостоятельной лабораторной работы студентами.

РАБОТА 1. Цветные реакции на белки и аминокислоты.

Теоретическая часть. Цветные реакции лежат в основе качественных проб, полуколичественных и количественных методов определения белков, аминокислот и продуктов их обмена в биологических жидкостях.

Практическая часть.Провести цветные реакции на белки и аминокислоты, оформить протокол:

1. Название работы.

2. Название реакции.

3. Принцип метода.

4. Результаты записать в таблицу:

№ п/п

Название реакции

Что открывают

Реактивы и условия

Наблюдаемый результат

4. Сделать вывод.

1.1. Биуретовая реакция на белки и пептиды. Принцип: в щелочной среде раствор белка при добавлении разбавленного раствора сульфата меди окрашивается в сине-фиолетовый цвет; окраска обусловлена образованием комплексов ионов меди с пептидными группами белка; биуретовую реакцию дают все белки, а также олигопептиды, содержащие не менее двух пептидных связей. Ход работы.К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка вносят 3 капли 10%-го раствора NaOH и 1 каплю 1%-го раствора CuSO₄. Наблюдают образование сине-фиолетового окрашивания.

1.2. Нингидриновая реакция. Принцип:при нагревании нингидрин образует с NH₃ , который выделяется при гидролизе из α-аминогрупп аминокислот, соединение сине-фиолетового цвета.Ход работы:к 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 5 капель раствора 0,5%-го раствора нингидрина; помещают пробирку в кипящую водя-ную баню на 5 мин. Наблюдают за развитием розово-фиолетового окрашивания, переходящего со временем в сине-фиолетовое.

1.3. Ксантопротеиновая реакция на ароматические аминокислоты (тирозин, фенилаланин, триптофан). Принцип:при нагревании с концентрированной азотной кислотой растворы белка дают желтое окрашивание; реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот.

Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 3 капли кон-центрированной HNO₃ и нагревают (осторожно!) в горячей водяной бане; появ-ляется осадок желтого цвета, пробирку охлаждают и добавляют 10 капель 10% NaOH – появляется оранжевое окрашивание.

1.3. Реакция Адамкевича на триптофан.Принцип: триптофан в кислой среде вступает в реакцию с глиоксиловой кислотой (альдегидами), образуя при этом окрашенные в красно-фиолетовый цвет продукты конденсации. Ход работы. К 5 каплям 1%-го раствора яичного белка добавляют 5 капель ледяной уксусной кислоты, которая всегда содержит небольшое количество глиоксиловой кислоты. Полученную смесь вначале нагревают 1-2 мин на водяной бане, затем охлаждают и по стенке пробирки осторожно, по каплям, чтобы жидкости не смешивались, добавляют 10 капель концентрированной серной кислоты. Помещают пробирку в кипящую водяную баню. Наблюдают образование красно-фиолетового кольца на границе раздела двух слоев.

1.4. Реакция Фоля на цистеин. Принцип: цистеин, содержащий сульфгидрильную группу (-SH), при нагревании подвергается гидролизу с образованием сульфида свинца Nа₂S. Ацетат свинца реагирует со щелочью с образованием плюмбита натрия:

(CH₃COO)₂Pb + 2NaOH → Pb(ONa)₂ + 2CH₃COOH
Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом дает черный (или бурый) осадок сульфида свинца: Na₂S + Pb(ONa)₂ + 2Н₂О → PbS↓ + 4NaOH.

Ход работы. К 5 каплям раствора яичного белка добавляют 5 капель 30%-ного раствора NaOH и 1 каплю 5% -ного раствора (CH₃COO)₂Pb. Помещают в кипящую водяную баню на 2-3 мин. Наблюдают появление черного или бурого осадка.

Практическое значение цветных реакций на белки и аминокислоты:

Ø Биуретовая реакция используется для качественного и количественного определения белка в биологических жидкостях.

Ø Нингидриновая реакция используется для качественного и количественного определения свободных аминокислот в биологических жидкостях.

Ø Цветные реакции на отдельные аминокислоты используются для изучения химического состава белков.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Цветные реакции на белки

Цветные реакции применяются для установления белковой природы вещества, идентификации белков и определения их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях. В клинической лабораторной практике эти методы используются для определения количества белка в плазме крови, аминокислот в моче и крови, для выявления наследственных или приобретенных нарушений обмена веществ у новорожденных.

Реакция №1 «Биуретовая реакция на пептидную связь»

Принцип: в основе биуретовой реакции лежит способность пептидных связей (-СО-NH-) образовывать с сульфатом меди в щелочной среде окрашенные комплексные соединения, интенсивность окраски которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор (белок куриного яйца фильтруют через марлю и разводят дистиллированной водой 1:10); 2) гидроокись натрия, 10% раствор; 3) сульфат меди, 1% раствор.

Ход определения: в пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, 3 капли гидроокиси натрия и 1 каплю сульфата меди, перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание.

Реакция №2 «Нингидриновая реакция»

Принцип: сущность реакции состоит в образовании соединения, окрашенного в сине-фиолетовый цвет, состоящего из нингидрина и продуктов гидролиза аминокислот. Эта реакция характерна для аминогрупп в -положении, которые присутствуют в природных аминокислотах и белках.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) нингидрин, 0,5% водный раствор.

Ход определения: в пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, добавляют 5 капель раствора нингидрина и нагревают до кипения. Развивается розово-фиолетовое окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое.

Реакция №3 «Ксантопротеиновая реакция»

Принцип: при добавлении к раствору белка концентрированной азотной кислоты и нагревании появляется желтое окрашивание, которое в присутствии щелочи переходит в оранжевое. Сущность реакции заключается в нитровании бензольного кольца циклических аминокислот азотной кислотой с образованием нитросоединений, выпадающих в осадок. Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан).

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) концентрированная азотная кислота; 3) гидроокись натрия, 10% раствор.

Ход определения: к 5 каплям раствора яичного белка добавляют 3 капли азотной кислоты и (осторожно!) нагревают. Появляется осадок желтого цвета. После охлаждения добавляют (желательно на осадок) 10 капель раствора гидроокиси натрия, появляется оранжевое окрашивание.

Реакция №4 «Реакция Адамкевича»

Принцип: аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.

Реактивы: 1) неразбавленный яичный белок; 2) концентрированная (ледяная) уксусная кислота; 3) концентрированная серная кислота.

Ход определения: к одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной кислоты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют каплями около 0,5 мл серной кислоты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.

Реакция №5 «Реакция Фоля»

Принцип: аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы – SH, подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия Na2S. Последний, взаимодействуя с плюмбитом натрия (образуется в ходе реакции между ацетатом свинца и гидроокисью натрия), образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% раствор; 2) реактив Фоля (к 5% раствору ацетата свинца прибавляют равный объем 30% раствора гидроокиси натрия до растворения образовавшегося осадка).